Bizans İmparatorluğu döneminde Ayasofya, büyük bir "kutsal emanetler" zenginliğine sahipti. Bu emanetlerden biri de 15 metre yüksekliğindeki gümüş ikonostasis idi.[16] Konstantinopolis Patriği'nin kilisesi ve Doğu Ortodoks Kilisesi'nin 1000 yıl boyunca merkezi olan Ayasofya, 1054 yılında Patrik I. Mihail'in Papa IX. Leo tarafından aforoz edilmesine şahitlik etmiş olup, bu olay, genel olarak "Schisma"nın, yani Hristiyanlık tarihindeki en önemli olaylardan biri olan Doğu ve Batı kiliselerinin ayrılmasının başlangıcı sayılır.
1453 yılında kilise, Osmanlı padişahı II. Mehmed tarafından camiye dönüştürüldükten sonra mozaiklerinden insan figürleri içerenler tahrip edilmemiş (içermeyenlerse olduğu gibi bırakılmıştır), yalnızca ince bir sıvayla kaplanmış ve yüzyıllarca sıva altında kalan mozaikler, bu sayede doğal ve yapay tahribattan kurtulabilmiştir. Cami, müzeye dönüştürülürken sıvaların bir kısmı çıkarılmış ve mozaikler yine gün ışığına çıkarılmıştır. Günümüzde görülen Ayasofya binası, aslında aynı yere üçüncü kez inşa edilen kilise olduğundan "Üçüncü Ayasofya" olarak da bilinir. İlk iki kilise isyanlar sırasında yıkılmıştır. Döneminin en geniş kubbesi olan Ayasofya'nın merkezî kubbesi, Bizans döneminde bir kez (7 Mayıs 558 tarihinde çökmüştür